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    【技术总结】 池锝网 2018-06-06本文已影响

    篇一:分子标记技术总结

    F2群体的特点 F2群体构建比较省时,不需很长时间便可得到一个较大的群体,这是使用F2群体进行遗传作图的最大优点。

    F2群体中存在杂合基因型,对于显性标记将无法识别显性纯合基因型和杂合基因型,由于这种基因型信息简并现象的存在,会降低作图的精度。

    通过远缘杂交而来的F2分离群体,则远缘杂交亲本后代向两极疯狂分离,标记比例易偏离3:1。

    延长F2使用时间的措施 采用无性繁殖,如进行组织培养扩繁、留蔸再生等。

    使用F2单株的衍生系(F3株系或F4家系),将衍生系内多个单株混合提取DNA,则能代表原F2单株的DNA组成。从衍生系中选取单株必须是随机的,且株数要足够多。

    BC1群体 亲本1 × 亲本2 F1 × 亲本1或2 BC1 BC1群体的特点 BC1群体中每一分离的基因座只有两种基因型,它直接反映了F1代配子的分离比例,因而BC1群体的作图效率是最高的。

    由于该群体的配子类型较少,统计及作图分析较为简单,但提供的信息量少于F2群体,且可供作图的材料有限,不能多代使用。

    对于一些人工杂交比较困难的植物,BC1群体不太适合用来作图,一是难以建立较大的BC1群体,二是容易出现假杂种,造成作图的误差。

    RIL群体 亲本1 × 亲本2 F1 F2 多代自交一粒传 F6或F7 RIL的特点 RIL群体一旦建立,就可以代代繁衍保存,有利于不同实验室的协同研究,而且作图的准确度更高。

    异花授粉植物由于存在自交衰退和不结实现象,构建RIL群体比较困难。

    建立RIL群体相当费时。

    DH群体 亲本1 × 亲本2 F1 花药培养等途径 双单倍体(DH)群体 DH群体的特点 DH植株是纯合的,自交后即产生纯系,因此DH群体能够稳定繁殖,长期使用。

    DH群体的遗传结构直接反映了F1配子中基因的分离和重组,因此DH群体与BC1群体一样其作图效率是最高的。

    构建DH群体需精湛的花培技术和染色体加倍技术,同时所提供的信息量也明显低于F2群体。

    植物的花培能力跟基因型关系较大,因而花培过程会对不同基因型的花粉产生选择效应,从而破坏DH群体的遗传结构,造成严重的偏分离现象,影响到遗传作图的准确性。

    中 中 大 大 必要的群体规模 高 高 低 低 准确度 1:1 1:1 1:1 1:2:3或3:1 分离比例 品系 品系 个体 个体 性状研究对象 F2个体自交后代 F1花粉分化个体 F1回交后代 F1自交后代 群体 形成 RIL DH BC1 F2 不同作物群体的特点 * 分子标记及辅助育种技术 分子标记的类型: 第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术,包括RFLP、DNA指纹技术等; 第二类是以PCR为核心的分子标记技术,包括RAPD、简单序列重复标记SSR、序标位STS、序列特征化扩增区域SCAR等; 第三类是一些新型的分子标记,如:SNP标记、表达序列标签EST标记等。

    分子标记的特点: (1)直接以DNA的形式表现,表现稳定 (2)数量多 (3)多态性高 (4)表现为中性,不影响目标性状的表达; (5)许多标记表现为共显性的特点,能区别 纯合体和杂合体。

    (6)成本不太高 RFLP标记 植物基因组DNA上的 碱基替换、插入、缺失 或重复等,造成某种限 制性内切酶酶切位点的 增加或丧失,从而产生 限制性片断长度多态 性。

    基 本 步 骤 用DNA限制性内切酶消化 Southern杂交 放射性自显影或酶学检测 DNA提取 凝胶电泳分离,转移到滤膜上 A 无表型效应,不受环境条件和发育阶段的影响。

    B 等位基因之间是共显性的,在配制杂交组合时不受杂交方式的影响。

    C 在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应,因而互不干扰 D RFLP标记起源于基因组DNA的自身变异,在数量上几乎不受限制 E DNA需要量大,检测技术繁杂,难以用于大规模的育种实践中。在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的标记。

    RFLP标记的特点 RAPD标记 RAPD引物扩增电泳检测结果 S104GGAAGTCGCC S105AGTCGTCCCC S106ACGCATCGCA S107CTGCATCGTG S108GAAACACCCC S109TGTAGCTGGG S110CCTACGTCAG S111CTTCCGCAGT S112ACGCGCATGT (1)不需DNA探针,引物设计无须知道序列信息; (2)显性遗传(极少数共显性),不能鉴别杂合子和纯合子; (3)技术简便,不涉及分子杂交和放射性自显影等技术; (4)样品需要量少,引物价格便宜,成本较低; (5)实验重复性较差,结果可靠性较低。

    RAPD标记的主要特点: AFLP标记 EcoR I / Mse I酶切 EcoRI接头 A C PCR 预扩增 连接 接头 MseI接头 A N N N N C 选择性 PCR 聚丙烯凝胶 电泳和硝酸 银染色检测 AFLP标记PAGE电泳结果 (1)由于AFLP分析采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多,所以该技术所产生的标记数目是无限多的; (2)每次反应产物的谱带在50-100条之间,所以一次分析可以同时检测到多个座位,且多态性极高; (3)表现共显性,呈典型孟德尔式遗传; (4)分辩率高,结果可靠; (5)目前该技术受专利保护。

    AFLP标记的主要特点: (简单重复序列) SSR标记 (1)数量丰富,广泛分布于整个基因 (2)具有较多的等位性变异; (3)共显性标记,可鉴别出杂合子和纯合子; (4)实验重复性好,结果可靠; (5)由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息,因此其开发有一定困难,费用也较高。

    SSR标记的主要特点: 简单重复间序列(ISSR)标记 SNP标记 SNP密度高,分布广,平均约每1000对碱基出现 一个SNP。

    两个无关个体间约有300万个SNPs。

    其它分子标记技术 DAF (DNA amplification fingerprinting,DNA扩增指纹) AP-PCR (arbitrary primer PCR) SCAR (sequence characterized amplified region,序列特异性扩增区) STS (sequence tagged site,序列标签位点)、 SSCP (single strand confirmation polymorphism,单链构象多态性)、 CAPS (cleave amplified polymorphic sequence)。

    等。。。。。。。

    分子标记辅助选择的遗传学基础 标记辅助选择的主要方面是对目标基因的选择,有人称之为前景选择(foreground selection)。

    前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间连锁的紧密程度。若只用一个标记对目标基因进行选择,则标记与目标基因间的连锁必须非常紧密,才能够达到较高的正确率。

    供体 受体 RR Rr rr (1-r)2 2r(1-r) r2 M R m r M R m r 目标基因与DNA标记间的遗传距离位p 亲本中DNA标记的带型 F1杂种中DNA标记的带型 在F2分离群体中分子标记类型 即MM,Mm,mm MM类型的分子标记所代表的目标基因型及其频率 利 用 MAS 的 遗 传 基 础 (以 RFLP 为 例) M—抗性标记 R—抗性基因 m—感病标记 r—感病基因 选择的正确率随重组率的增加而迅速下降。重组值越小,其错选率越低。

    如果要求至少选到一株目标基因型的概率为P,则必须选择具有标记基因型MM的植株至少为: n=log(1-P)/log(1-p) 式中p=(1-r)2 对基因组中其他部分(即遗传背景)选择,称为背景选择(background selections)。背景选择的对象几乎包括了整个基因组,因此,这里牵涉到一个全基因组选择的问题,在分离群体中,由于在上一代形成配子时同源染色体之间会发生交换,因此每条染色体都可能是由双亲染色体重新组装的杂合体。

    分子标记的优越性 1.克服性状表现型鉴定的困难 2.允许早期选择 3.控制单一性状的多个(等位)基因的利用 4.允许同时选择多个性状 5.可进行性状非破坏性评价和选择 6.从育种进程考虑,可加快育种进程,提高育种效率 开展分子标记辅助选择应具备的主要条件 A:与目标基因紧密连锁的分子标记 B: 简便快捷的标记检测方法 目标基因的标记筛选(gene tagging)是进行分子标记辅助选择(MAS)育种的基础。用于MAS育种的分子标记须具备三个条件: 分子标记与目标基因紧密连锁 标记实用性强,重复性好,而且能够经济简便地检测大量个体。

    不同遗传背景选择有效。

    遗传作图的原理 其原理是基于染色体的交换与重组。在细胞减数分裂时,非同源染色体上的基因相互独立,自由组合,而位于同源染色体上的连锁基因在减数分裂前期I非姊妹染色单体间的交换而发生基因重组,用重组率来表示基因间的遗传距离。遗传图谱只显示基因间在染色体上的位置,并不反映DNA的实际长度。

    遗传图谱的构建与农艺性状基因的标记 构建遗传图谱的主要环节: 根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合,建立作图群体。

    对群体中不同植株的标记进行基因性分析。

    借助计算机程序构建连锁群 用于分子标记的遗传作图可分为两类: 暂时性分离群体:包括F2、F3、F4、BC、三交群体等,这类群体中分离单位是个体,一经自交或近交其遗传组成就会发生变化,无法永久使用,由于每个单株所提供的DNA有限,且只能使用一代,限制了该群体的作图能力; 永久性分离群体:包括RIL、DH等,这类群体中分离单位为株系,不同株系之间存在基因型的差异,而株系内个体之间的基因型是相同且纯合的,自交后不会发生分离,因此可通过自交或近交繁殖后代,而不会改变群体的遗传组成,可以永久使用。

    亲本1 × 亲本2 F1 F2 F2群体 *

    篇二:分子标记技术总结

    常用DNA分子标记类型和特点

    依据对DNA多态性的检测手段,DNA标记可分为四大类:

    第一类为基于DNA.DNA杂交的DNA标记。主要有限制性片段长度多态性标记(RFLP)、可变数目串联重复序列标记(VNTR)、单链构象多态性RFLP(SSCP、RFLP)等;

    第二类为基于PCR的DNA标记。主要有随机扩增多态性DNA(RAPD),简单重复序列DNA

    标记(SSR),测定序列标签位点(STS),表达序列标签(EST),测序的扩增区段(SCAR);

    第三类为基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记。主要有两种,一种是扩增片段艮度多态性(AFLP),第二种是酶解扩增多态顺序(CAPS);

    第四类为基于单核苷酸多态性的DNA标记。主要是单核苷酸酸多态性(SNP)。

    各类常用分子标记的特点和应用如下:

    引物设计方法

    特点

    应用

    多态性原因

    RAPD

    以几个随机寡核苷酸(常用10个)为引物

    简便、易行、灵敏、安全性好、 DNA用量少,能快速进行基因多态性研究,但重复性较差

    遗传资源保存、遗传多样性研究、种质资源鉴定、遗传资源分类、品种纯度鉴定、遗传图谱的构建、突变检测、基因标记和基因组比较

    多态性是由于引物与不同区段的同源序列结合,产生不同的DNA产物

    RFLP

    以单拷贝或低拷贝的DNA克隆(基因组

    DNA或cDNA)作探针

    共显性、信息完整、稳定性、重复性好

    品种鉴别和品系纯度鉴定、分子标记连锁图谱构建、基因定位、种质鉴定和遗传背景分析、遗传多样性分析

    多态性主要足由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA序列中

    单碱基的替换、DNA片段的插入、缺失、易位和倒位等引起

    SSR

    两端序列较保守, SSR引物根据与微卫星重复序两端的特定短序列设计,用来扩增重复序列本身,从而揭示微卫星的多态性。

    共显性、信息完整、稳定性重复性好,操作简单

    生物遗传作图、基因定位、群体遗传研究、个体间亲缘关系鉴定

    多态性是由于SSR座位的基本单元重复次数的小同而形成

    SNP

    DNA测序中碱基的峰

    高和面积变化,已有DNA序列比较,设计特定区域DNA片段的PCR引物,扩增

    相虑DNA片段并进行

    序列比较

    SNP的数量极其丰

    富,并且可以进行自动化检

    适应于复杂性状的遗传分析、引起群体差异的基因识别

    多态性足由于单个核苷酸的变异所引起

    AFLP

    用两种能产生黏性末端的限制性内切酶将基因组DNA切割成分子量人小不等的限制性片段,然后将这些片段与其末端互补的已知序列的接头连接,所形成带接头的特异片段用作随后的PCR反应模版,PCR引物5’端与接头和酶切位点序列互补,3’端在酶切位点后增加1~3个选择性碱基

    不需要预先知道

    DNA序列信息的情况下就可以同时进行多数DNA酶切片段的PCR扩增,既有RFLP的可靠性又有RAPD的方便性

    构建高密度的遗传

    连锁图,DNA指纹

    图谱构建

    多态性是由于酶切位点和其后的选择性碱基的变异

    SCAR

    根据RAPD或AFLP碱

    基序列设计特异引物

    克服了RAPD标记

    的不稳定性,   AFLP标记的难操作性

    生物遗传作图、基因定位

    多态性是由于引物与不同区段的同源序列结合,产生不同的DNA产物

    CAPS

    适合于扩增产物的限

    制性内切酶

    是一些特异引物

    PCR标记的延伸

    适应于性状连锁标

    记的发掘

    多态性是由于特异PCR产物DNA序列内限制性晦切位点变异

     

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    篇三:分子标记技术总结

    分子标记技术在植物研究中的应用 院(系)名 称: 理学院 专 业 名 称: 生物科学 学 生 姓 名: 曲悦 指 导 教 师: 孟令波副教授 哈尔滨学院 2016年5月 学 号 12054214 密 级 公 开 分子标记技术在植物研究中的应用 The application of molecular markers in plant research 学生姓名:曲悦所在学院:理学院所在专业:生物科学指导教师:孟令波职称:副教授所在单位:哈尔滨学院论文提交日期:2016.05.24论文答辩日期:2016.06.03 学位授予单位:哈尔滨学院 目 录摘要 IIIABSTRACT IV前 言 V第1章 绪论 1 1.1分子标记技术类型 1 1.2 分子标记技术的特点 2 1.3 分子标记技术的原理和遗传特性 2第2章 RFLP分子标记技术及其在植物研究中的应用 3 2.1 RFLP标记的原理及特点 3 2.2 RFLP技术在植物研究中的应用 3 2.2.1构建DNA指纹图谱 3 2.2.2 进行基因定位 4 2.2.3鉴定物种多样和亲缘关系 4第3章SSR分子标记技术及其在植物研究中的应用 5 3.1 SSR标记的原理 5 3.2 SSR标记的特点 5 3.3 SSR标记技术在植物研究中的应用 5 3.3.1 构建分子遗传连锁图谱 6 3.3.2 基因定位 6 3.3.3 亲缘关系和遗传多样性研究 6 3.4 SSR分子标记技术的优点和不足: 7 3.4.1 SSR技术的优点: 7 3.4.2 SSR技术的不足: 7第4章 SNP分子标记技术及其在植物研究中的应用 8 4.1 SNP技术标记的原理 8 4.2 SNP技术标记的特点 8 4.2.1遗传稳定性高 8 4.2.2 等位基因性 8 4.2.3 检测速度快 9 4.2.4 分布广泛,数量丰富 9 4.2.5 代表性强 9 4.3 SNP技术在植物研究中的应用 10 4.3.1SNP分子标记技术在物种遗传多样性上的应用 10 4.3.2 SNP分子标记技术种间亲缘关系间的应用 10 4.3.3 SNP分子标记技术在种植资源关系上的应用 11 4.4SNP技术的优点和不足 11 4.4.1 SNP技术的优点 11 4.4.2 SNP技术的不足 11第5章 AFLP分子标记技术及其在植物研究中的应用 12 5.1 AFLP标记的原理 12 5.2 AFLP标记的特点 12 5.3 AFLP技术在植物研究中的应用 12 5.3.1基因指纹图谱的构建 13 5.3.2 品种鉴定 13 5.4AFLP技术的优点和不足 13 5.4.1 AFLP技术的优点 14 5.4.2 AFLP技术的不足 14参考文献 15结论 17致 谢 18 分子标记(Molecular Markers),是在分子水平上把具有遗传性的物质中核苷酸序列的变异作为研究基础的遗传标记方式。分子标记的数量是庞大到不可预估;在生物发育的不同时期,来自各个组织中的DNA都可以用分子标记的方法进行分析[1]。分子标记技术从上世纪首次被发现之后在无数学者锲而不舍的努力研究下,从开始的RAPD.RFLP,到后来的SSR又在SSR的基础上加以改善创造了ISSR,再到后来的AFLP SNP,每一项技术都有它们独特的优势,但也都存在着不足,正是由于每个技术都不是完美的,才需要不断的研究进步。目前为止分子生物学技术已经发展到十分精确的程度,DNA分子标记技术也以达到几十种,这里主要介绍其中的4种标记方法,包括RFLP SSR SNP AFLP 分子标记技术。

    分子标记技术广泛应用于动物植物遗传育种基因检测等方面,本文介绍其在植物学研究中的应用。

    关键词:分子标记;植物学研究;DNA序列检测;RFLP;SNP;AFLP;SSR ABSTRACT Molecular Markers is based on the nucleotide sequence variation of genetic material among inp>

    第1章 绪论1.1分子标记技术类型按技术特点,分子标记技术可分为3类。分别是以分子杂交为基础的DNA标记技术主要是RFLP标记[3]。以PCR反应为基础的各种DNA指纹技术。PCR技术首创于1985年,由MULLIS等在模板DNA引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应,合成特异DNA片段的一种方法。PCR反应分为变性 复性和延伸3个阶段。在下文中会详细描述。第三类是一些新型的分子标记,这里不做详细介绍[3]。1.2 分子标记技术的特点 分子标记是发展较早的遗传标记, 它是 DNA 水平的标记其主要是对发育时期的生物个体、甚至细胞进行检测, 在不受环境基因是否表达的限制外, 多态性丰富、数量庞大、及操作简便也是其优点, 分子标记为植物学研究提供了方便快速的方式, 目前已有RFLP, RMAPD, SSR, RAPD, AFLP等分子标记我在这里主要介绍4种标记技术。RFLP 、SSR、SNP和 AFLP 。分别介绍其特点(一)RFLP 又叫限制性片段长度多态性标记,它的特点是用放射性同位素或者非放射性物质标记DNA,然后将具有放射性的DNA作为探针与膜上DNA进行杂交,经过放射自显影或酶学检测后即可显示该片段多态性情况。(二)SSR 此项技术的特点是依据其两侧特定的引物进行PCR扩增,技术更全面,因此又称它为基于全基因组DNA扩增其微卫星领域。

    (三)SNP 是根据单个碱基的突变为基础而提出的。由于突变的方向各异,所以有突变引发的多态性也相当的高。因此它的遗传稳定性很强。现在称它为继RFLP和SSR之后的第三代标记技术。(四)AFLP 这项技术是对限制性酶切片的选择性扩增。技术更精确,因而又称作基于PCR的RFLP。1.3 分子标记技术的原理和遗传特性 在分子标记技术发展的过程中,AFLP RAPD SSR SRAP等多种新型标记技术在多种植物领域获得成功应用。与其精确科学的原理是密不可分的。不同的标记技术应用的 原理各不相同,主要是针对DNA序列进行体外扩增 对引物进行筛选,选出多态性高 遗传稳定的DNA谱带筛选过后针对这些谱带进行电泳扩增可以扩增出大量谱带再次进行筛选[4]。各种技术的具体技术原理在下文中进行详细介绍。在遗传特性方面来说,分子标记技术达到了前所未有的高度,我们知道分子水平是非常精确的,而分子标记是严格利用碱基互补配对原则 扩增DNA然后进行十分细致的筛选,因而精确度极高,选定出的DNA谱带也是遗传性状高可以稳定遗传的优良基因。应用分子标记的遗传稳定性高的特点,已经繁育出品种优良的红麻,大豆 ,茄子,小麦。以及DNA图谱的制作。这项技术目前主要应用于基因定位, 构建分子图谱, 种质资源分类与遗传多样性研究以及辅助育种等方面[5]。 第2章 RFLP分子标记技术及其在植物研究中的应用 2.1 RFLP标记的原理及特点RFLP分子标记技术是发现最早(上世纪70年代已被发现),也是目前世界上应用范围最广的一项分子标记技术。1980年首次应用于人类基因连锁图谱的绘制。目前该技术已经广泛应用于动植物连锁图的构建,重要基因的分子标记及筛选等研究领域。该项技术的原理是录用植物基因组DNA上碱基 缺失、插入、重复、替换,等从而造成限制性内切酶酶切位点的缺失或增加,这种现象导致了限制性片段长度不一,也就是多态性。这些片段具有特异性,因此它可以作为DNA特有的指纹[6]。RFLP技术是因为核酸序列不同导致DNA片段之间产生等位基因差异的结果,即由于在限制性切点间的点突变、重排、缺失、等原因从而引起基因型间限制性片段长度发生变异,如果想要检测RFLP,就要在提核DNA后用限制性内切酶酶解,酶解后通过电泳分开,然后再经过转膜,最后, 在进行杂交的同时进行自显影。用RFLP分析方法可显示出两条同源染色体之间特异位点的限制性片段[8]。在同源染色体上同一位点对应的条带所对应的限制性条带如果相同就会出现一条条带,如果不同就会出现不止一条的条带[8]。这些等位基因之间的带型的差别就可以代表一个限制性片段长度多态性 也就是RFLP.。如果观察到一个RFLP ,则可用检测出这个RFLP的酶探针追踪这个RFLP位点在分离群体中的遗传状况,在整个作图群体中,因为每一个RFLP位点上的等位基因依照孟德尔规律遗传,因此,RFLP标记可用传统的方式来进行遗传分析,把基因位点归入连锁群[6]。在这些连锁群中,标记间的顺序和遗传距离都能估计出来,所以可以作出一个RFLP的遗传连锁图谱。若要在RFLP连锁图谱上定位一个特定性状的相关基因。第一步,要在图谱群体的原来个体中进行准确的测量,然后,寻找性状与RFLP标记位点之间的相关关系。如果一个性状与它对应的标记紧密相连,这些标记就可以不用等到该片段基因表达之后而事先检测出该基因型是否拥有与所研究性状相关的染色体片段。简而言之此项技术是以一系列随机排列的碱基顺序的核苷酸单链为引物,以所研究基因组DNA为模板进行PCR扩增,经35 至40 个循环,产生大量长度不同的多态性DNA 片段,扩增产物通过电泳进行分离,再经过染色来检测扩增产物DNA片段的多态性。因此,RFLP分子标记技术的一个优点就是它可以直接反应同源染色体上的核苷酸碱基序列之间的差异,它的分析过程与基因表达与否没有关系,我们把这种RFLP遗传连锁技术应用称为(MAS)标记辅助筛选技术[7]。 2.2 RFLP技术在植物研究中的应用2.2.1构建DNA指纹图谱 1980年植物学家比斯坦因首次提出分子标记技术可用于建立遗传连锁图谱的设想以来,凯尔乐 道易思等利用这一设想的原理成功建立了第一张人的RFLP图谱,目前利用这一技术在植物学领域已建立了多种植物和蔬菜等的RFLP图谱。RFLP图谱在国内外得到了成功的应用。(1)1998年,中国农业大学生物学院分子遗传实验室利用RFLP图谱定位了玉米矮生基因的5个QTL位点[7]。(2)1992年,法拖肯利用RFLP图谱定位了红豆种子重量的QTL位点。[8](3)1988年,彼得森跟据马玲薯的RFLP图谱,定位了控制果实性状的6个QTL位点。[9]2.2.2进行基因定位RFLP分子标记的一大特点就是数量化,数量性状的每个等位基因就是一种多态性基因,而RFLP又是DNA多态性的一种代表量度,因此RFLP技术可用来对数量性状基因进行定位,主要的方法包括: 以标记为基础的分析法和以性状为基础的分析法(TB法) 区间作图法。主要应用于水稻、玉米等作物的研究[9]。

    2.2.3鉴定物种多样性和亲缘关系基因定位和分子图谱的构建更加有利于物种亲缘关系和遗传多样的研究,这样为种质资源的保存、收集、等以及探索物种起源奠定了基石。

    第3章SSR分子标记技术及其在植物研究中的应用3.1 SSR标记的原理 SSR标记又叫微卫星标记。微卫星DNA分布于整个基因组的不用位置上,其两端的序列多是单方向拷贝序列。根据这个,设计一对特异引物,在利用PCR技术扩增,在通过电泳分析多态性[10]。同一类型的微卫星DNA分布十分广泛,它的范围涉及整个基因组的不同位置上,因为每个位点上的折叠形态和重复次数的不同造成多态性各异。人和动物大多数为TG重复而植物主要为AT重复。SSR标记重复性好,呈共显性标记,多态性好的特点。基因组建立SSR标记必须克隆出数量足够的SSR进行测序并设计相应的PCR引物。

    3.2 SSR标记的特点 SSR两侧特定的引物是进行PCR扩增的原料,这项技术扩增范围很广,它扩增的范围是全基因组DNA。它检测到的一般是一个单一的复等位基因位点。它兼具PCR反应的优点,多态性较高。

    3.3 SSR标记技术在植物研究中的应用随着基因学科的发展,大量基因组序列被测定出来,给研究 SSR 序列的人们提供了丰富的资源。SSR 的分布很广泛涉及到植物整个基因组,包括编码区非编码区。随着 SSR技术的发展,在玉米、高粱、水稻、桑树、花生、人参、黑松、大豆、小麦等基因组的DNA 序列中都发现了大量的 SSR 位点为作物品种的检测鉴别提供了大量的依据。3.3.1 构建分子遗传连锁图谱遗传图谱又叫连锁图谱。它表示各标记物种的基因在其染色体上的位置,是进行基因定位、克隆、性状遗传和植物育种等学科的应用基础,为基因组学遗传学以及遗传育种等领域的研究提供理论依据。具体应用举例:(1)在水稻研究方面:Susan 等把水稻染色体上的 SSR 整合到已构建好的 RFLP 遗传图谱上,完成了SSR构建的水稻遗传图谱[11]。(2)在大豆研究方面:Akkage 等构建了包括34 个 SSR 标记的大豆遗传图谱。[11] (3)在花生研究方面:Moretzsohn 等从433 对 SSR 引物中选出了 204 个遗传性状稳定、多态性高 的引物,绘制出了花生的遗传连锁图,并计算出了每个标记之间的距离。[11] 3.3.2 基因定位 基因定位就是将与目的基因紧密连锁的遗传标记进行精确的定位,并确定这些遗传标记在染色体上的具体位置。

    具体应用举例:(1)在水稻研究方面:Blair 等发现在水稻中有3个微卫星基因与白叶枯病抗性基因相连锁。[12](2)在玉米研究方面:Song 等通过 SSR 引物绘制了高油玉米的遗传连锁图。[12](3)在玉米研究方面:王凤格等通过利用SSR标记构建了玉米的遗传连锁图谱,同时进行了玉米的遗传效应分析。[12] 3.3.3 亲缘关系和遗传多样性研究生物遗传多样性是通过基因型控制的,导致的性状差异,以此来维持生物的抗性、繁殖能力及对所处环境变化能否做出适应性调整的能力等进行的研究,从而为生物种质资源的培育、利用等提供理论依据。具体应用举例: (1)在玉米研究方面:Barcaccia 等利用SSR 标记对意大利一种玉米品种的种质资源进行了遗传多样性及亲缘关系的分析。[13](2)在甜菜研究方面:Desplanque 等利用 SSR 标记技术分析后得出了野生甜菜比栽培甜菜具有更丰富的遗传多态性。[13] (3)在马铃薯研究方面:王绍鹏等利用四对 SSR 引物对马铃薯品种进行了多态性分析,总共检测出了144 个多态性位点。[13] 3.4 SSR分子标记技术的优点和不足:3.4.1 SSR技术的优点:SSR标记的优点主要有[14]: (1)SSR技术所扩增出的产物覆盖了整个基因组,数量丰富;(2)SSR技术扩增产物为共显性遗传,因此可以很好的区分纯合子和杂合子; (3)SSR技术所需要的 DNA 数量少,且对 DNA 质量要求不高;(4)SSR技术扩增出的产物重复性高,可以通用于各种品种间;(5)SSR技术实验操作简便,易于学习掌握。3.4.2 SSR技术的不足: SSR 标记技术主要的缺点是它并不具有AFLP技术的在测定前不需要知道基因组序列的优点,当它在基因组未测序的情况下,想要获得微卫星,需要知道序列两端的序列信息,引物要根据微卫星两端的序列设计,因此不易获得[14]。

    第4章 SNP分子标记技术及其在植物研究中的应用 前面讲到每个分子标记技术都有各自的遗传多态性差异,多态性越高的技术不仅实用起来更为便利,而且代表着此项技术更为高端更为相关学者所接受。多态性高自然联想到的关键词为“突变”这也是本章SNP技术的灵魂所在[15]。以前知道突变是不定向的,但是可以人工诱导,DNA序列中的四种碱基ATGC由于排列不同突变点不同由哪个碱基突变等,这些问题由此引发出基因组的多态性差异之大。SNP技术就是利用基因组DNA中某个单一碱基发生突变而形成多态性的一项分子标记技术。4.1 SNP技术标记的原理 SNP标记技术在1994年首次在科学杂志上与世人见面,但当时这项技术并不全面,在之后的1996年它才被正是提出并命名。在98年之后才逐渐发展壮大到如今。SNP是单核苷酸多态性的缩写,它的原理就是利用基因组DNA单个碱基发生的突变从而引起的高多态性。假设一个基因组的某个位点上有一个碱基发生突变,就称为一个SNP。由于SNP分布广泛,几乎在任意一个位点都可以找到数量不同的SNP位点,所以SNP得分布位置分成3类:编码区SNP(cSNP)非编码区SNP(rSNP)调控区SNP(pSNP)。其中同义cSNP技术虽然是根据突变为原理的分子技术但它并不影响所翻译出的产物氨基酸的种类,而另一种非同义cSNP则会导致氨基酸变化进而影响蛋白质的合成。SNP碱基的突变大都是在TC之间。目前SNP技术在许多领域都发挥着重要作用[16]。4.2 SNP技术标记的特点 4.2.1 遗传稳定性高 相比于SSR技术的高多态性,SNP技术的多态性就比较低了,原因是它的突变仅发生在单个碱基之间。由于多态性不高,所以它的遗传稳定性很高。

    4.2.2 等位基因性 SNP标记最常见的就是发生在2个等位基因之间,这种特性成为二态性也叫等位基因性(也存在极少部分的发生于3或4个等位基因间)。因为这种特性,基因频率就比较容易估计。

    4.2.3 检测速度快 SNP技术的一大优点是通过直接测序便可对比差异,从而避免了其他技术还要测量长度的步骤。也因此它有着独特的优势,而分子检测技术的高水平发展,推动着SNP技术逐渐走向成熟。SNP本身从分布上数量上量都很大由很广,现在又研制出通量很高的检测仪器,使得SNP的检测速度很快。

    4.2.4 分布广泛,数量丰富在动植物基因组中SNP分布十分广泛。每1000个碱基对中就会出现一个SNP,整个基因组算下来数据是非常之大的。

    4.2.5 代表性强存在一部分的SNP可能使蛋白质的功能发生改变,由此引起的改变有可能导致生物体变异或病变,可以为生物学病理学提供参考依据。

    4.3 SNP技术在植物研究中的应用SNP技术由于它自身独特的技术特性和遗传最稳定的优点,受到很多领域的追捧。由于它是根据基因序列变化产生的多态性,所以它是随着科学测序的精确发展而发展的,由于我国地产丰富,科学发展迅速,对林业农业上的乱砍乱伐严重,许多珍稀物种濒临灭绝,所以利用SNP技术分析物种多样性和鉴定种质资源显得尤为重要。它可以保护濒危物种的种质资源。

    4.3.1 SNP分子标记技术在植物遗传多样性分析上的应用 遗传多样性是人们为了研究与保护生物系统而研究的核心之一,遗传多样性具有两种属性:即广义与狭义。第一种属性为:地球上所有的生物所携带的遗传信息的总和,这个概念称为广义的遗传多样性。另一种属性是:遗传多样性指的是物种内的遗传多样性,即种内一个群体之间或个体之间不同个体的遗传变异的总和,这个概念称之为狭义的遗传多样性。这里相关学者总结出:一个物种的遗传多样性越高,对外界环境变化的适应能力就越强,遗传变异就越丰富,这种情况就说明物种生存繁衍的能力越强[17]。

    这里列举5个著名的利用SNP技术对不同植物的研究[18]:在油菜研究方面:吴金锋等对甘蓝型油菜进行了 SNP 和 SSR 遗传多样性的分析, 他挑选出了能够进行种植资源结构分析的SNP 位点和SSR 位点,再进行SNP分析,结果成功地把所测群体分为3个生态类型;在葡萄研究方面:荷兰科学家撒摸索等在葡萄上利用SNP对葡萄基因组进行了研究,对葡萄做了遗传多样性方面的评价。在柑橘果树研究方面:魏召新对柑橘和其近缘亲属植物进行了SNP筛选,通过对筛选后的谱带进行聚类分析,将柑橘类果树分成五个类群。在枇杷研究方面:王俊等对枇杷的两个品种进行了SNP 分析,发现不同品种之间存在较丰富的遗传多样性,利用筛选出的SNP标记进行了遗传多样性的分析。在茶方面的应用:张成才等对茶树基因组进行了SNP 标记,成功地将3个变种中分离出17份材料,并研究了遗传多样性。4.3.2 SNP分子标记技术种间亲缘关系间的应用SNP分子标记技术能够用于种间亲缘关系的分析,这对植物学进行遗传育种和品种鉴定分类具有十分重要的意义。下面举出了SNP技术在2个领域中的应用[19]:(1)在大麦研究方面:孔塔等分析了大麦品种7个基因型的一百多个位点,结果发现了72个SNP标记点,这些标记点均能应用于亲缘关系的研究。(2)在荔枝研究方面:孙清明将他们自己研发的 SNP和SSR 等 2 种分子技术应用于品种鉴定,结果发现御金球这一种全新的荔枝种。并对这一全新的品种进行了亲缘关系的鉴定,首次向人们展示了这一全新的荔枝品种。

    4.3.3 SNP分子标记技术在种质资源关系上的应用 SNP 分子标记技术在种质资源的分类和鉴定中也发挥着十分重要的利用价值,有助于加快培育新的品种。

    下面举出了SNP技术4在个领域中的应用[20]:(1)在玉米研究方面:在90年代初期 Shattuck-Eidens 等第一次将SNP 技术用于鉴别领域,从而鉴别出了不同的玉米品种。

    (2)在大麦研究方面:英国科学家Brunner 等在大麦领域开发了大麦抗性SNP 标记,这些标记可用于优良种质的鉴定。 (3)在甜瓜研究领域:威姆等从甜瓜公共基因组数据库中找到了45个SNP 位点,将甜瓜已有的基因图谱进行了扩充,并通过SNP 标记对甜瓜品种进行了鉴定。

    (4)在番茄研究方面:赵婷婷等将SNP分子标记技术应用于番茄基因上,从中筛选出碱基突变位点,进行分析后获得了含有抗性基因的番茄,为培育和鉴定新型抗病品种做出了贡献。

    4.4 SNP技术的优点和不足 本章对SNP技术做了简要的介绍,它被称作分子技术中的潜力股,有着广泛的应用前景,但也存在着不足,这里简要概括:4.4.1 SNP技术的优点SNP分子标记技术与其他分子标记技术相比,有以下4个优点[12]: (1) 高通量。(2)灵敏度高。(3)反应速度快。(4)更加节省成本4.4.2SNP技术的不足SNP 分子标记技术的不足之处就是 :需要使用精确仪器,专业要求特别严格。

    第5章 AFLP分子标记技术及其在植物研究中的应用AFLP分子标记技术是来自荷兰Keygene公司的科学家马利克和皮特于1993年所创造发明的一种分子标记技术。这项技术是对限制性内切酶的选择性扩增。该项技术的多态性很强,一次就可检测到100-150个扩增产物,这是其他技术所不能比拟的,因此它得出的扩增数据非常适合绘制基因的指纹图谱,也非常有利于遗传多样性的研究,它是目前国际上最实用的基因指纹技术[21]。5.1 AFLP标记的原理 AFLP分子标记技术,它主要是利用限制性内切酶片段各异的长度来检测DNA多态性的一种分子标记技术,它得基本原理是首先对基因组DNA进行双酶切,得到两种酶切产物,其中一种是酶切频率高的限制性内切酶,另一种为频率较低的内切酶。选取频率高的进行扩增,其目的是为了产生易于扩增且能分离出大小合适的片段。选取频率低的是为了限制扩增的DNA片段[22]。AFLP扩增的数量多少是由频率低的限制内切酶在基因组中的酶切位点的多少来决定的。将酶切位点和与它具有相同粘性末端的人工接头连接,连接后的接头序列和邻近内切酶识别位点一同作为下一步PCR反应的引物结合位点,在通过设计在末端分别添加1-3个选择性碱基的不同引物,它在进一步选择性识别具有特异配对序列的酶切片段,识别完成后将他们结合,这样特异性扩增就可以完成。最后用聚丙烯酰氨凝胶电泳对扩增产物进行分离,扩增出的片段长度的不同是检出多态性的依据[15]。

    5.2 AFLP标记的特点AFLP分子技术目前被世界研究领域普遍接受是因为它有着独特的优点:它结合了RFLP的稳定性和PCR技术的高效性,它并不需要从开始就知道DNA的序列信息因此可以用于任何动植物基因组的研究。而且AFLP的多态性远远超过其他分子标记技术,利用放射性同位素标记在聚丙烯酰胺凝胶电泳上就可检测出几十条AFLP扩增产物,只需要进行一次PCR检测,就可以同时检测出多个遗传位点,因此它是所有分子技术中多态性最丰富的。AFLP技术遵循孟德尔遗传定律,大多数是共显性表达,无等位效应等优点。本章对AFLP技术的优缺点特性进行了简要的总结[22]。 5.3 AFLP技术在植物研究中的应用 5.3.1 基因指纹图谱的构建 AFLP 技术在种群基因鉴定方面体现出巨大的优势,它可以一次性检测出众多位点,这是其它分子标记技术所无法比拟的。随着研究的深入发展,AFLP 技术首先在植物遗传育种标记方面取得了很大的成功。具体应用举例[23]: (1)在田瓜研究方面:Wang等将AFLP技术应用于田瓜基因组的研究,从而构建了甜瓜的遗传连锁图谱。

    (2)在马铃薯研究领域:Meksem等在分析了马铃薯原有的分子遗传连锁图谱的基础上,用AFLP技术进行分析,总结出了马铃薯上染色体的基因连锁关系。

    (3)在辣椒研究领域:Ben等以印度小果辣椒品系和灯笼型辣椒品种杂交出的子二代为群体作图,构建出了辣椒的指纹图谱。

    (4)在白菜研究领域:卢刚利用白菜杂交建立出的子二代为分离群体,构建出了白菜的遗传图谱。

    5.3.2 品种鉴定 AFLP技术在短时间内扩增出的多态性产物数量十分巨大,因而非常适合鉴定各种系的基因指纹,这是 AFLP 最适当的应用范围,另外也是 Zabeau 和 Vos 取得成功的关键。具体应用举例[24]:(1)在菜豆研究领域:Tohme 等用 AFLP技术分析了多种菜豆品种,从而构建了菜豆基因文库。(2)在苹果研究领域:祝军等人用 AFLP 标记技术来鉴定苹果品种,从中选出了多态性丰富遗传稳定性强的品种。从而分析了苹果重要品种的 AFLP 指纹图谱的遗传多样性。(3)在人参研究领域:罗志勇等首次用 AFLP 技术构建了人参和西洋参的基因指纹图谱,分离出了具有丰富多态性的品种,这对于鉴别真假人参等提供了非常有效的理论依据。

    5.3.3 辅助育种AFLP技术是从分子水平上对样品进行分析,根据和基因连锁的分子标记的角度来 检测样品的目的基因的,从而提高了选育的目的性、准确性,令整个育种周期变短,减少了成本的投入[25]。应用举例:(1)在大豆研究方面:陈受宜等用 RFLP、SSR 和 AFLP 三种标记分析了大豆属种并构建了大豆相关种的分子系统,对大豆的栽培的进化和育种具有十分重要的意义。(2)在甘蓝研究方面:采用AFLP标记技术,通过甘蓝雄性不育系材料的筛选,获得了能够鉴别显性雄性不育纯合基因的标记。5.4AFLP技术的优点和不足 AFLP技术是所有分子技术中多态性最丰富的,被人们广泛认可,但也存在着不足之处; 5.4.1AFLP技术的优点:(1)AFLP技术只需要少量的模板DNA。(2)AFLP 技术的引物比别的技术的引物多,因此它的重复性和可靠性更高。(3)AFLP 不需要预先知道模板基因组的序列。(4)AFLP技术的多态性是其他技术的10-100倍。5.4.2 AFLP技术的缺点: 该项技术受到专利保护,而且对样品DNA的纯度及内切酶的质量要求比较高 参考文献[1] 朱玉贤. 现代分子生物学[M].北京:高等教育出版社,2012:13. [2] 张天真. 作物育种学总论[M].南京:中国农业出版社,2011:281-283.[3] 李学林.分子标记技术在在植物遗传育种中的应用进展[D].河南: 河南科技大学,2012.[4] Zhang Q F. Improvement of Bacterial Blight Resistance of Hybrid Rice by Molecular Marker-assisted Selection[J].华中农业大学学报, 2011, 19(3):172- 173.[5] 王和勇. RFLP AFLP SNP分子标记技术及其在植物研究中的应用[D].西安: 西安师范大学,2013.[6] Carswell EA,Old. L.J, et al,Proc.Natl.Acad.Sci[J].USA,2011,72(1).[7] 赵君.RFLP分子标记技术及其在植物研究中的应用[D].内蒙古: 内蒙古农业大学,2014.[8] 李珊珊.SSR分子标记技术及其在植物研究中的应用[D].吉林:吉林农业大学,2013.[9] 李少华.SSR分子标记技术及其在水稻研究中的应用[D].湖南:湖南研究院,2014.[10] Zhang L,Yuan D,Yu S,et al.Preference of simple sequence repeats incoding and non-coding regions of Arabidopsis thaliana [J].Bioinformatics,2014,20(7):1081-1086.[11] 熊易平.应用SSR分子标记鉴定超级杂交水稻组合及其纯度[J].中国水稻科学,2015,19(2):95- 100.[12] 薛灿辉.SSR技术在马铃薯研究中的应用[D].湖南: 湖南农业大学,2011.[13] Aggarwal.B.B.,Moffat,B.,et al,J.Biol.Chem[M].2008,259:68-69.[14] Paquet Alain.Levesque Anm,et al,Journal of hromatographyA[M],2012,667:125-130.[15] 张天真. 作物育种学总论[M].南京:中国农业出版社,2011:281-283.[16] 张天真. 作物育种学总论[M].南京:中国农业出版社,2011:292-294.[17] 姚丹青.SNP标记技术及其在植物研究中的应用[D].北京:中国林业科技大学,2015.[18] Alencar S,Silva-Junior O, Togawa R,el al.SNP discovery in apple cultivars using next generation sequencing[J].BMC Proceedings,2011,5(7):42.[19] Jin-kee Jung, Soung-Woo Park, Wing Yee Liu, et al.Discovery of single nucleotide polymorphism in Capsicum and SNP markers for cultivar identification[J]. Euphytica. 2010,175 (1):91-107.[20] 候雷平.AFLP分子标记技术在蔬菜研究中的进展[D].山西:山西农业大学,2010.[21] 刘峰.AFLP分子标记技术及其在植物研究中的应用[N].黑龙江省科学学报,2013-04-25(B1).[22] Pradhan A K, Gupta V, eta.l Theor Appl Genet, 2013, 106: 607~614[23] Lu G Y, Yang G S, Fu T D. Plant breeding, 2014, 123: 262~265.[24] 李锡香,杜永臣.园艺学报[N] ,2004, 31(3): 309~314.[25] 周李华.广东茶树种质资源遗传多样性 AFLP 分析[D].湖南:湖南农业大学硕士学位论文,2012. 本文标题为:分子标记技术及其在植物研究中的应用。围绕这个主题,我在文中首先介绍了分子标记技术的概念:它是在分子水平上以DNA中的碱基变异为基础的分析技术,分子是一项对精确度要求十分高的技术,它发展到如今已经在许多领域中取得了成功,任何事物的发展都是曲折的必要经历不少磨难,分子标记发展的过程也是如此,从上世纪首先被发现,中间一直在完善,从低阶技术发展到如今的AFLP、SNP,精确度不断在提高。要研究分子技术在植物研究中的应用,接下来列举了4种技术分别的进行了阐述。RFLP,它的发现是最早的而且一直沿用至今,依靠碱基的4种变异,来实现它的多态性,作为古老的技术,它所需要的原料多,而且测量起来不那么容易;SSR,它本名微卫星标记,顾名思义,它的多态性是极其丰富的,它根据DNA两端的单拷贝序列设计它自身的引物,在用PCR进行扩增,最后在来电泳分析。SNP,相比较前两个,它是比较“年轻”的,即便如此,它却有着它独特的魅力,它的遗传稳定性是最高的,但由于它的单一的变异,相比较之下就少了好多的可能,结果就导致了它的多态性较别人少,即使这样它的分布范围广数量丰富,也弥补了这一项缺憾。最后一项,AFLP,不得不夸夸它,在这四种分子技术里它是多态性最丰富的,要知道多态性是分子技术的灵魂,抓住了灵魂,就会被人们普遍认可,所以它是目前全世界应用最广泛的技术,唯一的遗憾是,这项技术对待测基因的纯度要求非常高,而且我们想用它也不那么容易,因为它受专利保护。在实际应用中我也在正文中列举出事例,分子技术带给人们太多好处,在农业,林业,分子生物,对开发新物种以及濒危物种的保护等等。每一项技术都不可能达到完美无瑕,这也是今后的研究的动力。本次论文在导师孟令波老师的关心和耐心指导下,通过自己的不断努力完成。记得在大二的时候我们上过孟老师的分子生物学,那时候觉得分子研究是一个十分高难的学科,本次论文也正是分子研究的方面,所以一些专业性的问题是经过孟老师指导及外出造访相关学者一起解决,所以本次论文对我来说不仅是一个考验,更是对我这四年来专业知识的一个总结。在整个论文制作过程中,孟老师都给了我精心的指导,对我的一些专业知识上的误差及论文格式上的疏漏他都以科学严谨的态度给我一一指正,本次论文的完成和孟老师的指导是分不开的。在此谨向孟老师致以最诚挚的感谢。

    再次希望老师们对论文设计中存在的问题进行批评指导。最后,再次向在整个论文设计中所有帮助过我的同学、老师表示衷心的感谢。

    摘 要 哈尔滨学院学士学位论文 哈尔滨学院学士学位论文 摘 要 哈尔滨学院学士学位论文 第一章 绪 论 哈尔滨学院学士学位论文 第一章 绪 论 哈尔滨学院学士学位论文 第二章 RFLP分子标记技术及其在植物研究中的应用 哈尔滨学院学士学位文 第二章 RFLP分子标记技术及其在植物研究中的应用 哈尔滨学院学学位论文 第三章 SSR分子标记技术及其在植物研究中的应用 哈尔滨学院学士学位论文 第三章SSR分子标记技术及其在植物研究中的应用 哈尔滨学院学士学位论文 第三章SSR分子标记技术及其在植物研究中的应用 哈尔滨学院学士学位论文 第四章SNP分子标记技术及其在植物研究中的应用 哈尔滨学院学士学位论文 第四章 SNP分子标记技术及其在植物研究中的应用 哈尔滨学院学士学位论文 第四章SNP分子标记技术及其在植物研究中的应用 哈尔滨学院学士学位论文 第四章 SNP分子标记技术及其在植物研究中的应用 哈尔滨学院学士学位论文 第五章 AFLP分子标记技术及其在植物研究中的应用 哈尔滨学院学士学位论文 第五章 AFLP分子标记技术及其在植物研究中的应用 哈尔滨学院学士学位论文 第五章 AFLP分子标记技术及其在植物研究中的应用 哈尔滨学院学士学位论文 参考文献 哈尔滨学院学士学位论文 哈尔滨学院学士学位论文 致 谢

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